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?樣本固定?
成骨誘導分化結束后，吸去培養基，用1×PBS輕柔洗滌細胞2~3次?23。
加入4%多聚甲醛或10%福爾馬林固定液，室溫固定30分鐘?12。
?洗滌與風干?
去除固定液后，用蒸餾水或1×PBS沖洗3次以去除殘留固定劑?12。
風干載玻片或培養板，確保樣本干燥?34。
?染色處理?
加入0.1%茜素紅染色液（溶于0.05M Tris-HCL緩沖液，pH8.3），37℃孵育5-30分鐘（時間依鈣鹽含量調整）?12。
染色后迅速用蒸餾水沖洗，避免染料殘留導致背景過深?23。
?復染與觀察?
可選固綠染色液復染1分鐘以增強背景對比度?34。
顯微鏡下觀察：鈣結節呈橙紅色，背景為綠色或粉紅色?23。
?保存?
染色后樣本用封口膜密封，4℃保存可維持染色效果2周?23。
?操作輕柔?
避免劇烈震蕩或長時間暴露于液體中，防止鈣結節脫落?12。
?染色條件優化?
染色液使用前需恢復至室溫，染色時間根據鏡下鈣鹽沉積量動態調整（通常5-10分鐘）?23。
染色過深時可用1%鹽酸酒精分色?4。
?試劑選擇?
推薦使用商品化茜素紅S試劑（如Beyotime ST1078-5g），純度穩定?5。
固定劑優先選擇中性福爾馬林，避免酸性條件干擾鈣鹽結構?24。
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