研究背景：

細(xì)胞不斷感知和響應(yīng)微環(huán)境中的生化和生物力學(xué)變化，需要?jiǎng)討B(tài)代謝適應(yīng)。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）硬化是癌癥侵襲性的標(biāo)志，而基質(zhì)剝離下的生存也與不良預(yù)后相關(guān)。細(xì)胞通過(guò)整合素共軛結(jié)合的焦點(diǎn)附著斑（FAs） 感知ECM的物理特性，影響細(xì)胞遷移、分化和存活。由于組織纖維化和ECM硬化與腫瘤預(yù)后不良相關(guān)，通過(guò)膠原蛋白消耗或賴(lài)氨酸氧化酶（LOX）抑制或藥物改變細(xì)胞機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)抑制ECM硬化已成為癌癥治療的有希望的選擇。腫瘤細(xì)胞如何在堅(jiān)硬的基質(zhì)上獲得生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，而在基質(zhì)脫離時(shí)抵抗失巢凋亡死亡仍然是一個(gè)謎，其作用機(jī)制仍不清楚。

失巢凋亡是一種特殊形式的程序性細(xì)胞死亡。正常貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞在失去與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的黏附或細(xì)胞間相互接觸受到破壞后，因無(wú)法從周?chē)h(huán)境中獲得生存信號(hào)而啟動(dòng)的一種細(xì)胞凋亡程序。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過(guò)程，其中包括腫瘤細(xì)胞從原發(fā)腫瘤組織脫離、侵入周?chē)M織、進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)、在遠(yuǎn)處器官黏附和定植等環(huán)節(jié)。失巢凋亡在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要的屏障作用。正常情況下，脫離原發(fā)腫瘤組織的腫瘤細(xì)胞由于失去了與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，應(yīng)該發(fā)生失巢凋亡而死亡，從而限制了腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散。然而，腫瘤細(xì)胞往往通過(guò)多種方式逃避失巢凋亡，這使得其能夠在血液循環(huán)中存活并轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)端器官，形成轉(zhuǎn)移灶。

在本研究中，研究人員詳細(xì)介紹了整合素/GSK3 β/FTO/MTOR軸在乳腺癌進(jìn)展中的作用：乳腺癌細(xì)胞通過(guò)該信號(hào)軸整合剛度感知，以確保剛性基質(zhì)賦予的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)和基質(zhì)剝離下細(xì)胞的抗失巢凋亡能力。

圖1 作用模式圖

研究結(jié)果：

1. 基質(zhì)硬化激活mTORC1通路，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)

研究的結(jié)果表明，在剛性培養(yǎng)條件下，使用mTORC1抑制劑雷帕霉素和/或肌球蛋白II抑制劑blebbistatin抑制細(xì)胞收縮力后，細(xì)胞生長(zhǎng)顯著降低。RNA-Seq的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)在硬基質(zhì)培養(yǎng)條件下的上調(diào)特征基因富集在mTORC1信號(hào)通路。此外，與軟基質(zhì)相比，多種細(xì)胞在硬基質(zhì)條件下的phos-S6水平顯著增加，而總S6水平?jīng)]有明顯變化。同時(shí)，AKT和AMPKα磷酸化水平無(wú)顯著差異，這表明mTORC1在硬化條件下激活的特異性。

圖2 硬基質(zhì)培養(yǎng)條件下mTORC1激活介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)

2. mTORC1在硬基質(zhì)上的激活受基于整合素的FAs調(diào)控

為研究FAs是否參與底物剛度誘導(dǎo)的mTORC1激活，研究人員首先使用免疫熒光染色，檢測(cè)到mTOR/Phos-S6與FA標(biāo)記蛋白paxillin或vinculin在硬基質(zhì)而不是軟基質(zhì)上的強(qiáng)共定位。而使用blebbistatin干擾硬基質(zhì)培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞收縮性時(shí)，共聚焦和超分辨率STED成像表明mTOR和phos-S6的特異性FA定位消失。表明FAs在硬基質(zhì)誘導(dǎo)的mTORC1激活中起關(guān)鍵作用。

圖3 mTORC1在硬基質(zhì)上的激活受基于整合素的FAs調(diào)控

此外，mTOR蛋白質(zhì)水平和mTORC1活性的同時(shí)減低只在敲低??1整合蛋白時(shí)發(fā)生。同時(shí)，整合素??1的敲低阻礙了mTOR/phos-S6和paxillin在硬基質(zhì)上的共定位，并降低了 mTORC1的活性。這些結(jié)果揭示了整合素??1在基質(zhì)硬度介導(dǎo)的mTORC1激活中的重要作用。

3. 軟基質(zhì)通過(guò)調(diào)節(jié)m6A RNA甲基化降低mTOR蛋白豐度

進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)軟基質(zhì)上的細(xì)胞或敲低黏著斑蛋白顯著降低mTOR蛋白水平，而Raptor、mLST8或DEPDC6豐度無(wú)變化。MG132在對(duì)照組中導(dǎo)致mTOR蛋白的積累。而在blebbistatin處理的細(xì)胞中，這種增加被減弱；這暗示在低收縮力下，mTOR蛋白的合成可能受到阻礙，導(dǎo)致總mTOR降低，而兩組間mTOR降解無(wú)明顯差異。表明在軟基質(zhì)下mTOR水平的下降,收縮力的降低是由于蛋白合成受到抑制而非降解增強(qiáng)引起的。

圖4 基質(zhì)剛性調(diào)節(jié)mTOR豐度和m6A水平

此外，blebbistatin干預(yù)后mTOR mRNA減少，但熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)mTOR mRNA轉(zhuǎn)錄能力時(shí)，在blebbistatin干預(yù)后無(wú)顯著差異。相比之下，使用放線(xiàn)菌素D阻斷 RNA合成并監(jiān)測(cè) mRNA穩(wěn)定性時(shí)， blebbistatin干預(yù)后 mTOR mRNA的降解速度明顯加快。使用SRAMP軟件在線(xiàn)預(yù)測(cè)了位于mTOR mRNA 3'UTR的5個(gè)非常高置信度的m6A修飾位點(diǎn)，在blebbistatin治療后，Me-RIP qPCR的結(jié)果顯示所有五個(gè)位點(diǎn)都表現(xiàn)出升高的m6A修飾。這些數(shù)據(jù)表明剛性敏感的m6A變化可能介導(dǎo)mTOR蛋白豐度在不同剛度或細(xì)胞收縮性條件下的改變。

4. FTO磷酸化鏈接剛性傳感與mTOR m6A修飾

隨后，研究人員分析了甲基化酶/去甲基化酶METTL3、METTL14、WTAP、VIRMA、FTO和ALKBH5的干擾對(duì)硬基質(zhì)和軟基質(zhì)條件下mTOR和phos-S6蛋白變化的影響。發(fā)現(xiàn)FTO是參與mTOR m6A修飾的去甲基化酶。RIP-qPCR的結(jié)果表明，blebbistatin處理的細(xì)胞中mTOR mRNA被FTO富集較對(duì)照組減少。表明mTOR mRNA和FTO之間的相互作用可能在低收縮性下被破壞，留下更多的m6A修飾完整而沒(méi)有有效擦除。在不同硬度下，F(xiàn)TO的亞細(xì)胞定位和蛋白水平均未見(jiàn)明顯變化，而在blebbistatin處理的細(xì)胞中，F(xiàn)TO泛磷酸化絲氨酸水平升高，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)FTO的Ser 256位點(diǎn)磷酸化修飾是FTO調(diào)控mTORC1的關(guān)鍵。

5. GSK3β定位在FA區(qū)域，磷酸化FTO激活mTORC1

人類(lèi)FTO中的重復(fù)共識(shí)基序“256S/T- e - dd -S/T(P)260" 與GSK3的底物識(shí)別基序 “S/T- x - x - x -S/T(P)"相匹配。實(shí)驗(yàn)表明，使用CHIR-98014 抑制GSK3β可降低FTO的磷酸化，而通過(guò)降低細(xì)胞張力激活FTO則會(huì)產(chǎn)生相反的效果；同時(shí)發(fā)現(xiàn)CHIR-98014處理軟基質(zhì)培養(yǎng)的細(xì)胞后，phos-S6水平恢復(fù)。此外，免疫共沉淀的結(jié)果表明，F(xiàn)TO與GSK3β存在直接結(jié)合。GSK3的亞細(xì)胞定位研究發(fā)現(xiàn)，GSK3在細(xì)胞質(zhì)中主要是彌漫性的，但在細(xì)胞的腹側(cè)顯示斑塊樣結(jié)構(gòu)，與paxillin在FA位點(diǎn)共定位。

圖5 GSK3通過(guò)與整合素的相互作用，在磷酸化FTO中起著重要作用

而錳離子增加了GSK3的ser9上的磷酸化；同時(shí)，在硬底物與軟底物上培養(yǎng)的細(xì)胞中phos-GSK3 (Ser9)升高，但總GSK3水平?jīng)]有顯著變化。這些結(jié)果確定了GSK3在基質(zhì)強(qiáng)度誘導(dǎo)的FTO和mTORC1激活中的潛在作用，以及其潛在機(jī)制可能涉及整合素??1。

5. ECM脫離過(guò)程中mTORC1調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的作用機(jī)制

ECM脫離，相當(dāng)于一個(gè)極其柔軟的基質(zhì)，已被報(bào)道誘導(dǎo)代謝應(yīng)激導(dǎo)致失巢凋亡，自噬可以 保護(hù)細(xì)胞免受損傷，促進(jìn)與ECM的再附著，研究在低黏附基質(zhì)上培養(yǎng)MDA-MB-231和MEF細(xì)胞時(shí)，觀(guān)察到LC3B-II水平升高和mTOR及phos-S6水平下降。表明了自噬水平的升高。

圖6 基質(zhì)剛性通過(guò)mTORC1信號(hào)調(diào)控自噬

隨后，懸浮MEF較貼壁細(xì)胞碘化丙啶（PI）染色率，而自噬藥理抑制劑氯喹（CQ）的干預(yù)進(jìn)一步增強(qiáng)了細(xì)胞死亡程度。在雷帕霉素處理的細(xì)胞中，細(xì)胞死亡的增強(qiáng)明顯減弱。通過(guò)血清刺激激活mTORC1后，也觀(guān)察到CQ治療對(duì)細(xì)胞死亡的類(lèi)似影響。表明基質(zhì)分離能夠通過(guò)抑制mTORC1活性增強(qiáng)自噬，從而促進(jìn)細(xì)胞對(duì)失巢凋亡的抵抗并提高生存率。此外，在多個(gè)腫瘤細(xì)胞系中觀(guān)察到，LC3B-II蛋白在硬底物或高收縮力的細(xì)胞中減少，而在軟底物或低收縮力的細(xì)胞中增加；且TEM觀(guān)察到低收縮性細(xì)胞中自噬體數(shù)量增加，提示軟基質(zhì)上自噬通量增強(qiáng)。另外，TSC2敲除細(xì)胞中硬基質(zhì)與軟基質(zhì)上LC3B-II水平的差異減弱。這表明基質(zhì)硬化以mTORC1依賴(lài)的方式阻礙自噬。最后，在DCIS患者連續(xù)切片組織樣本中，與正常乳腺上皮相比，分離細(xì)胞和腔細(xì)胞的LC3B水平更高，而分離細(xì)胞和腔細(xì)胞中相應(yīng)的mTOR 水平與LC3B呈反相關(guān)。

綜上所述，研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞代謝的雙相機(jī)制調(diào)節(jié)，與腫瘤在纖維化等硬化條件下的生長(zhǎng)以及癌癥轉(zhuǎn)移期間的失巢凋亡抗性有關(guān)?；|(zhì)硬化時(shí)可以通過(guò)整合素和GSK3β-FTO介導(dǎo)的mRNA m6A修飾激活mTORC1，提高mTOR水平，促進(jìn)合成代謝；在ECM脫離時(shí)抑制該軸增強(qiáng)自噬，進(jìn)而抑制失巢凋亡促進(jìn)細(xì)胞存活。

文獻(xiàn)給讀者的啟發(fā)在于揭示剛性感知在腫瘤進(jìn)展中的作用，一方面揭示實(shí)體瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中的新機(jī)制；另一方面揭示腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中脫離基質(zhì)后，腫瘤細(xì)胞通過(guò)自噬抵抗失巢凋亡促進(jìn)存活的生存策略。這種腫瘤細(xì)胞對(duì)基質(zhì)微環(huán)境的應(yīng)答機(jī)制有助于對(duì)腫瘤進(jìn)展的理解和靶向治療的開(kāi)發(fā)。